L'interno è a tre navate, presenta i caratteri della antiche chiese cristiane, col piccolo vestibolo d'ingresso (nartece) per i catecumeni e i penitenti e, in alto, la galleria per le donne (matroneo), aggiunta nel VII sec.; le arcate sono rette da pregevoli colonne coronate da capitelli tardo-romani e medioevali. Tutta la decorazione interna delle navate è opera ottocentesca fatta eseguire da Pio IX e realizzata da Andrea Busiri Vici (1818–1911) , in particolare si distinguono i ritratti dei pontefici benefattori della chiesa, e dei santi martiri. Il soffitto policromo è a cassettoni, di legno intagliato e dorato, realizzato nel 1606; si alternano le Sante Agnese, Costanza, Cecilia e gli stemmi di Pio IX, che lo restaurò nel 1855. Arco trionfale: il Martirio di s. Agnese, opera del pittore i Pietro Gagliardi (1809–1890).