L'interno, vasto e imponente, ha uno sviluppo solenne con ventidue colonne, provenienti dalla precedente chiesa benedettina di Santa Maria in Capitolio, le colonne sono materiale di spoglio provenienti dal Foro Romano. La navata centrale è delimitata da undici colonne per lato; la 3ª colonna sinistra, di granito roseo di Assuan e marmo bianco ha nella parte superiore un'iscrizione «A cubiculo Augustorum», che indica come essa provenga dalla stanza da letto dell'imperatore Augusto a ricordo della leggenda che narra come Augusto abbia avuto l'apparizione della Vergine col Bambino nella sua camera da letto. La colonna, che si ritiene in realtà eseguita in età tardoantica o medievale, è attraversata da un foro obliquo, probabilmente utilizzato per osservazioni stellari. Il ricco soffitto ligneo a cassettoni della Basilica fu realizzato da Girolamo Siciolante, detto il Sermoneta e da Cesare Trapassi (1572-75) con al centro la Vergine e il Bambino, e stemmi di Gregorio XIII, Pio V e del Senato romano, fu da quest'ultimo fatto eseguire, in ringraziamento della vittoria di Lepanto e il trionfo del grande capitano della flotta pontificia Marcantonio Colonna. Nella basilica sono conservate numerose tombe di uomini illustri del passato.